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agrisera AS08 300提取緩沖液說明書

更新時(shí)間：2020-12-02 點(diǎn)擊次數(shù)：1838

agrisera AS08 300提取緩沖液說明書

1 | PEB (4x) | protein extraction buffer

AS08 300 |提取緩沖液，用于從植物組織和藻類/細(xì)菌細(xì)胞中定量分離總可溶性/膜蛋白，優(yōu)化用于變性條件下的后續(xù)western blot檢測

數(shù)量 5 x 2 ml（4x儲備液）多可分離75種植物材料（對于100 mg新鮮重量，使用500 µl 1x PEB）或190種藻類材料（對于總4-10 µg的細(xì)胞量，使用200 µl 1x PEB）葉綠素）

存儲在室溫下穩(wěn)定至少1個(gè)月；在4°C下短期存儲（6個(gè)月），在-20°C下長期存儲（1年或更長時(shí)間）

經(jīng)過測試的應(yīng)用 蛋白質(zhì)提取

確認(rèn)反應(yīng)性 PEB已在來自高等植物，苔蘚，地衣，藻類，硅藻，鞭毛藻，藍(lán)細(xì)菌的各種物種和組織上進(jìn)行了測試。提取物可以使用去污劑（LDS）兼容的方法進(jìn)行定量，并且在隨后的SDS PAGE凝膠電泳，蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀（IP）中已顯示出高度可重復(fù)和定量的結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例

開始之前，
通過在無菌去離子水中稀釋4x儲備液為所有樣品準(zhǔn)備足夠的1x PEB（1x PEB的pH值應(yīng)在8.25至8.75之間）。建議在準(zhǔn)備立即使用的1x PEB時(shí)，從新鮮原料中加入蛋白酶抑制劑（此緩沖液不提供），以增加提取物中未降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。我們建議從新鮮制備的50x儲備液（以1x PEB）中加入1:50體積/體積，以得到制造商推薦的所需終濃度（例如，羅氏公司的Pefabloc SC為0.1 mg / ml）。

所需1x PEB的總體積取決于樣品類型和所用組織的數(shù)量：對于100 mg新鮮植物組織，我們建議使用500 µl 1x PEB。對于藻類樣品（相當(dāng)于4-10 µg總?cè)~綠素），我們建議200 µl 1x PEB。已發(fā)現(xiàn)將樣品體積保持在0.2-0.5 ml范圍內(nèi)有助于獲得更好的提取結(jié)果，不建議將樣品體積增大。

材料準(zhǔn)備

植物組織：稱重并在液氮中速凍，并在-80°C下儲存直至加工。
藻類培養(yǎng)物：離心形成沉淀或在過濾器（例如GF / F或聚碳酸酯）上收集并在-80°C冷凍直至進(jìn)行處理。

萃取

1個(gè)	用杵將預(yù)冷凍的研缽中的液態(tài)N ₂中的冷凍物質(zhì)研磨成細(xì)粉，然后轉(zhuǎn)移到1.5毫升試管中	在研磨過程中隨時(shí)保持物料冷卻，避免溢出
2	加入1x PEB，立即將樣品冷凍在液體N _2中	對于100 mg植物組織為500 µl，對于細(xì)胞為200 µl（對應(yīng)于4-10 µg總?cè)~綠素）；保持試管直立以將樣品固定在試管底部
3	小心地對樣品進(jìn)行超聲處理，直到樣品融化為止，立即將樣品重新浸入液體N _2中以避免加熱	使用微超聲儀（例如Branson Ultrasonics 450型）在約30％的低設(shè)置下可獲得佳結(jié)果；也可以使用水浴超聲儀，盡管這可能導(dǎo)致可再現(xiàn)的蛋白質(zhì)回收率略有降低；
4	根據(jù)不同的物種重復(fù)超聲處理（3），置于冰上，直到處理完所有樣品	對于高等植物，2-3個(gè)周期，藍(lán)細(xì)菌3個(gè)周期，衣藻2個(gè)周期，異源，Thalassiosira和Trichodesmium 1個(gè)周期
5	將樣品以10000 xg離心3分鐘以除去不溶物和未破碎的細(xì)胞，沉淀應(yīng)為白色/淺灰色	沉淀物呈深綠色表示不是佳破碎方法，需要使用新樣品調(diào)整提取條件（例如，改進(jìn)研磨和/或重復(fù)超聲處理步驟）
6	用移液管將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，注意不要帶走雜物	預(yù)計(jì)該植物的上清液約為400 µl，藍(lán)藻/藻類樣品的約為150 µl；用移液器收集上清液，因?yàn)? x 200（或2 x 75 µl）降低了干擾沉淀的碎片的風(fēng)險(xiǎn)

蛋白質(zhì)測定
使用去污劑相容性測定法測定回收的上清液的總蛋白質(zhì)含量。根據(jù)所用物種的數(shù)量和/或組織，您可能期望蛋白質(zhì)含量為1.5-6 µg / µl。

儲存
蛋白質(zhì)提取物可在+ 4°C下保存24小時(shí)，或在-20°C / -80°C下保存長達(dá)6/12個(gè)月。我們建議分裝樣品。重新冷凍蛋白質(zhì)樣品可能會導(dǎo)致降解/聚集。

裝載在凝膠上
應(yīng)將新鮮制備的還原劑（例如二硫蘇糖醇，終濃度為50 mM）添加到準(zhǔn)備裝載的體積中。在70°C加熱5分鐘，短暫旋轉(zhuǎn)并加樣在凝膠上。0.5-5 µg /泳道的蛋白質(zhì)負(fù)荷應(yīng)足以滿足大多數(shù)Western Blot應(yīng)用的要求。

附加信息

緩沖液成分（4x）：包含?40％v / v甘油[HOCH ₂ CH（OH）CH ₂ OH]，Tris-HCl [NH ₂ C（CH ₂ OH）₃·HCl] pH 8.5，LDS [CH ₃（ CH ₂）₁₁ OSO ₃ Li]，EDTA [（HO ₂ CCH ₂）₂ NCH ₂ CH ₂ N（CH ₂ CO ₂ H）₂]

建議在準(zhǔn)備立即使用的1x PSB時(shí)包括新鮮制備的蛋白酶抑制劑（此緩沖液不提供）。

PEB已針對從植物/藻類組織中提取全蛋白質(zhì)提取物的定量小規(guī)模制備進(jìn)行了優(yōu)化。使用以下描述的程序進(jìn)行提取將獲得大的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并減少蛋白質(zhì)的降解和聚集。

提取物可使用與??去污劑（LDS）兼容的方法進(jìn)行定量，并在隨后的SDS PAGE凝膠電泳，蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀中顯示出高度可重復(fù)和定量的結(jié)果。

PEB已在來自高等植物，苔蘚，地衣，藻類，硅藻，鞭毛藻和藍(lán)細(xì)菌的多種物種和組織上進(jìn)行了測試。

背景

PEB是一種提取緩沖液，用于破壞和溶解植物組織和藻類細(xì)胞中的總蛋白。與其他破壞細(xì)胞的方法相比，將陰離子去污劑LDS與推薦的程序（超聲處理和冷凍/融化循環(huán)的組合）結(jié)合使用可增加溶解和未降解蛋白質(zhì)的數(shù)量（請參閱參考資料）。對于1-2個(gè)樣品，推薦步驟的預(yù)計(jì)動手時(shí)間為20-30分鐘。預(yù)期的產(chǎn)量將為1.5-6 µg / µl總蛋白（從標(biāo)準(zhǔn)程序中回收），具體取決于原料，例如其生物學(xué)階段，使用的均質(zhì)化方法（打漿機(jī)與超聲處理）。

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